引言

全球人口超80亿，生产足够粮食的挑战变得越来越紧迫。然而，霜霉病等植物病害构成重大威胁，可能会破坏农民的收成。针对这一问题，代尔夫特理工大学的研究人员在《Nature Communications》期刊发表了一篇题为“Revealing real-time 3D in vivo pathogen dynamics in plants by label-free optical coherence tomography”的文章，该文首创了一种利用DOCT（Dynamic optical coherence tomography）实时无损监测植物感染的方法。这将有助于培育新的抗性作物，提高产量，同时减少农药的使用。

DOCT图像的建立过程如图1.a所示。在图1.b中显示了受乳球菌感染的生菜叶子的DOCT图像水平横截面，菌丝和吸器侵入海绵叶肉细胞（上）、植物对乳球菌感染的抗性导致的死亡海绵叶肉细胞（中）、表皮细胞和植物气孔（下）。通过对活孢子和死孢子的微分干涉对比显微镜和DOCT图的对比（图1.c），以及最大强度投影（MIP）分别在传统OCT图像、DOCT图像、同一样品的台盼蓝染色明场显微镜图像的对比（图1.d），可以证明DOCT可以对植物叶子内的菌丝进行无标记成像。图1.e为拟南芥栅栏叶肉组织中的霜霉病感染和辣椒植物根部的根结线虫感染的DOCT图像。

图1 DOCT成像

DOCT微表型分析

为了评估3D无标记植物病原体成像对微表型分析的价值，量化了三种不同生菜品种在叶子叶肉组织无症状定殖期间叶组织对霜霉病的感染水平。对DOCT显微表型分析的成像过程概述如图2.a。图2.b为DOCT图像的Bremia lactucae分割流程。通过分析48张DOCT图像中每张图像中的B.plantucae菌丝的存在并计算其体积和长度来进行定量表型分析（图2.ｃ）。在Bedford中有4/16被感染，在这少数受感染的Bedford样本中，感染程度较低，体积低于0.2 nl/mm²，长度低于3 mm/mm²，这表明Bedford能够抵抗感染，从而限制乳杆菌菌丝生长。Iceberg中有6/16被感染，比Bedford多50%。此外，乳杆菌菌丝也略有增加，如菌丝体积高达0.6 nl/mm²和长度高达8 mm/mm²。相比之下，Salinas品种有15/16的体积，并且乳杆菌菌丝存在于整个成像体积中。这也反映在量化体积达到2.3 nL/mm²和长度达到18 mm/mm²。与qPCR数据的比较表明（图2.d），基于DOCT的菌丝体积和长度定量与病原体-植物DNA比率一致。在Bedford样本的菌丝周围经常观察到死亡的植物细胞（图2.e），表明过敏性细胞死亡是抗性反应的一部分，相比之下，Iceberg的菌丝周围只有活的植物细胞，这表明了不同的抵抗机制。

图2 DOCT微表型分析

病原体生长的纵向成像

通过对易受影响的Salinas品种受感染的叶盘进行体内3D成像，展示了对乳杆菌时间发育的定量评估。在接种3天后菌丝的发育情况如图3.a所示。图3.b展示了从OCT图像中分割的菌丝，颜色表示生长时间。在12小时的单一时间间隔内，通常会形成数百微米长的菌丝，然后菌丝要么停止生长，要么生长到景深之外的更深层。此外，B.lactucae 菌丝在三个叶片段中的体积随时间变化表现出快速定殖，并在第6天左右达到最大值。它展示了菌丝生长的定量分析，使人们能够随时间追踪植物被 B.lactucae 定殖的进展（图3.c）。纵向双歧杆菌成像还显示，菌丝在一天内几乎完全失去了中频DOCT信号。图3.d显示菌丝首先在其整个体积中显示出强烈的中频信号（绿色），23小时后该信号消失，此时靠近菌丝壁仅保留微弱信号。新生长的明亮菌丝（图像顶部）表明活性丧失并非成像伪影。图3.e表明还可以在短时间尺度上检测到纵向生长。40分钟内，三个菌丝尖端（1-3）以平均速度分别为54 μm/h、105 μm/h和115 μm/h生长。15小时后观察到的同一区域显示，尖端2和3的菌丝继续生长并分枝（箭头），而尖端1的菌丝几乎没有进一步生长。这些例子说明DOCT能够在不同时间尺度以高分辨率捕获植物-病原体相互作用的空间和时间动态。

图3 病原体生长的纵向成像

结论

DOCT病原体成像为与植物病害易感性和抗性相关的细胞、组织和器官水平的微表型分析提供了机会，例如通过量化菌落大小、吸器发育和病害形态指数。其实时体内成像能力还有助于研究病原体对局部免疫反应或干预措施（例如施用杀虫剂或刺激抗性微生物）的反应。以这种方式测量和了解病原体感染的局部动态可以帮助制定成功的抗性育种策略。除了病原体和植物的结构成像之外，DOCT还可以对植物细胞和病原体的活性进行局部内在功能对比。这可以在感染过程中对活植物和病原体细胞内的生物和分子过程进行更详细的分析。