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《Biofabrication》：集成OCT的FRESH 3D生物打印

2022-11-30　来源：捷诺飞　作者：捷诺飞

【导读】

鉴于大多数的组织中结构-功能之间紧密相关，3D生物打印结构与目标结构的匹配至关重要。然而，对于水凝胶和细胞组成的工程组织具有软、易变形特征，亟需非接触、无损检测技术对其进行形态等特性的表征。

近期，卡内基梅隆大学的Joshua W Tashman团队在Biofabrication期刊上发表题为In situ volumetric imaging and analysis of FRESH 3D bioprinted constructs using optical coherence tomography文章。研究人员开发一种多材料生物打印平台，该平台集成了光学相干断层扫描（OCT）技术，用于原位体成像、误差检测和3D重建；并且还通过新型胶原生物墨水、明胶微粒支撑及路径优化改进悬浮水凝胶的自由可逆嵌入式（FRESH）3D生物打印。该平台可进行厘米级范围、微米分辨率的三维体成像，可检测三维体中的多种打印缺陷、进行实时打印层成像，提供了全面的打印质量评估，助力工程组织的临床转化。

集成OCT的高性能的3D生物打印机

研究人员开发了一套集成OCT的双挤出3D生物打印设备，允许在FRESH打印过程中进行原位体成像（图 1A）；设计了一个包含不同尺寸通道的基准模型（图 1B），用于评估该系统的打印分辨率及成像能力。将基准模型转为G-code（图 1D），在明胶微粒支撑浴中（图 1C）进行基准模型打印，并在打印过程中使用OCT成像。采用I型胶原蛋白生物墨水进行FRESH打印，完成后将基准模型从明胶微粒支撑浴中释放，清洗去除融化的明胶后使用相机成像（图 1E），可观察到外表面的通道，但缺乏内部结构和打印保真度的信息。

研究人员评估了基准模型在以下三种状态中的OCT成像(图 1F-H)：高度光散射的明胶微粒支撑浴、熔化微粒并重新固化明胶和水。实验的结果表明了散射和透明度对OCT成像的影响。同时，使用了信噪比公式量化这三种状态下获得的OCT图像的质量（图 1I），水中的信噪比呈线性衰减，信噪比高于另外两种状态，且水中所有通道的测量宽度（图 1H）与设计宽度之间的匹配度最高。

OCT图像的三维特性可以分割完整的内部和外部特征，对打印的基准模型进行三维重建（图 1K）——可观察到填充图案以及内部通道；但是由于信噪比的衰减，导致随着深度增加底层的重建不完整。

图1：光学相干断层扫描（OCT）与FRESH打印平台的集成与设计

高对比度胶原蛋白和连续成像结合来提高图像质量

研究人员在FRESH明胶微粒支撑浴中分别采用标准的I型胶原、高对比度I型胶原（加入了二氧化钛微粒）进行基准模型的嵌入式打印。使用高对比度I型胶原时，OCT图像质量在整个深度范围内明显提高（图 2A），信噪比增加3~4 dB（图 2B）。

研究人员使用第二个打印头打印明胶微粒作为支撑浴（图 2C），该打印头在打印期间以特定的间隔逐层填充容器（图 2D）。图 2E显示明胶微粒支撑浴和支撑浴内打印结构的G-code，图 2F显示打印和OCT图像采集的分步过程。在整个打印过程中，每打印10层进行一次OCT图像的采集，然后打印一层相同厚度的凝胶微粒进行支撑浴打印。最后将所有获得的OCT图像拼接和配准，形成最终的OCT图像。最终OCT图像显示了随着深度的增加，信号质量明显改善（图2G），信噪比不再随着深度的增加而衰减，深度增加2 mm后信噪比的值提高了>10 dB（图2H）。同时对打印的结构（图2I）的3D数据，分别评估10 mm的总体结构、1 mm的内壁宽度、550µm的丝间距（图2J-L），嵌入和释放结构的OCT测量结果非常一致；结构中的单个丝径定义为∼87µm，测量值为90 ± 5µm。

实验结果表明，结合高对比度胶原生物墨水、明胶支撑浴连续打印，序列OCT成像，可以提高图像质量，实现定量量纲分析。

图2：高对比度胶原蛋白生物墨水的开发、明胶微粒支撑浴的打印，以改进嵌入式OCT成像

通过提高明胶微粒支撑浴的透明度，提高图像质量

FRESH明胶微粒支撑浴的光散射严重影响其在打印过程中可视化结构，这源于明胶微粒和周围水介质的折射率（RI）不同，为了减少散射和高透明度，需要增加周围介质的折射率来匹配微粒（图3A）。研究人员将明胶微粒置于不同的浓度碘二醇，捕获图像并分析来确定实现一个透明的支撑浴中所需的RI（图3B）。使用这个折射率下的碘二醇制备一个高度透明的明胶微粒支撑浴（图3C）。

研究人员3D打印了一个底部倾斜的塑料容器，填充普通或透明的明胶微粒支撑浴，可以通过可视化打印层的深度来确定OCT在明胶微粒支撑浴中的穿透深度（图3D）。当通过普通明胶微粒支撑浴时，2 mm后图像质量下降，7 mm时无法观察到（图3E）；当通过透明的明胶微粒支撑浴时，图像质量得到了提高，并且7 mm仍然可以分辨（图3F）。在这两种情况下，信号的深度都呈指数衰减；与透明支撑浴相比，普通支撑浴中的信号衰减更快（图3G）。吸光度光谱分析表明，透明支撑浴在整个可见红外波长内透明度都有所提高（图3H）。

在透明明胶微粒支撑浴中FRESH打印的普通胶原蛋白丝，与周围的明胶微粒的对比度差异很小（图3I）。为此，研究人员使用高对比度胶原生物墨水在透明的明胶微粒支撑浴中FRESH打印，其对比度显著增加，信噪比增加了>30dB（图3J），并且可以在至少7 mm的深度获得高质量的OCT图像。

图3：透明的明胶微粒支撑浴增加了OCT信号到噪声和穿透深度

不同生物墨水在透明支撑浴中的图像质量

研究人员将胶原蛋白（Collagen-I）、纤维蛋白（Fibrin）、高对比度的胶原蛋白（Collagen+Tio2）、载细胞纤维蛋白生物墨水（Fibrin+cells）分别在普通的明胶微粒支撑浴、透明的明胶微粒支撑浴下，创建了空心管和方形网格的模型（图 4AB）；并且量化了在普通和透明明胶微粒支撑浴中打印的每个生物墨水的管状和正方形网格的OCT图像信噪比（图 4C-F），来确定OCT分辨率和穿透深度。

实验结果表明，使用透明明胶微粒支撑浴的OCT图像质量有所提升，随深度变化的信号衰减更小；相同的支撑浴中使用不同的生物墨水，OCT图像质量不同；载细胞纤维蛋白生物墨水中的细胞增加了光散射，这与高对比度胶原蛋白中的二氧化钛效果相似，均增加了在普通、透明明胶微粒支撑浴中的信噪比。

图4：在普通和透明的明胶微粒支撑浴中，不同生物墨水的OCT图像质量和信噪比对比

FRESH 3D生物打印结构的原位体成像及保真度评估

研究人员评估了透明明胶微粒支撑浴、高对比度胶原生物墨水和序列OCT成像在原位体成像中的联合作用，如图5A所示。对完成打印后再进行OCT成像会出现信噪比的线性衰减，导致深处信号损失；使用打印过程中序列OCT成像合成最终OCT图像的信噪比则不受深度影响。高对比度胶原生物墨水和透明明胶微粒支撑浴的结合，序列OCT成像可以检测打印缺陷和内部误差，如被困顶部气泡和通道堵塞（图 5CD）。并且，研究人员利用拼接合成的OCT图像生成打印结构的完整三维重建，与初始的CAD模型进行比较，使用测量软件量化空间偏差（图5EF）。该技术不仅可以对基本的缺陷进行检测，还可以对功能相关的打印偏差进行识别，研究人员为此设计了一个3D微流控混合网络（图5G）。采用高对比度胶原蛋白打印的混合网络（图5H），并在混合网络中设计了一个流道阻塞的缺陷（图 5I），该缺陷可由过度挤出、拖丝或Gcode路径误差导致。获取OCT成像结果后进行流道网络的提取，并进行定量3D测量分析，通过设置偏差容许值进行缺陷的自动检测。类似地缺陷检测不仅能在打印完成后进行分析，还可以在打印过程中逐层进行分析，无需等待多层打印和成像后再分析。

图5：FREASH打印结构的原位OCT成像和缺陷检测

复杂的三维解剖结构的原位成像和分析

除了上述基准模型和简单的几何网络结构，研究人员进一步地采用基于患者影像的解剖结构进行打印。如图6所示，研究人员选择了四种解剖结构，采用高对比度胶原蛋白在透明的明胶微粒支撑浴中进行打印机OCT成像，定量测量结果显示OCT打印成像的3D重建与计算机模型的偏差（红色过大，蓝色过小）。其中，图6（A）是内耳前庭的一段，可对本研究的设备进行压力测试，内部管道通畅，定量分析表明打印偏差小，约17.8±43.3μm。图6（B）是大脑动脉系统中Willis环的一部分，是一个没有支撑的血管网络。除了管状网络，研究人员还打印了实体器官组织。图6（c）所示为脑干模型，具有小尺寸的颅骨神经和表面复杂的丘脑，定量分析表明精细颅神经和丘脑细微表面特征的整体平均偏差为21.4±63.1μm。图6（D）所示为按比例缩小的肾脏，已测试该设备打印发咋内部结构的能力。OCT图像证实了肾脏厚度的高保真打印，分割的3D表面清晰地显示了外部和内部特征。该实例表明FRESH 3D生物打印具备采用胶原蛋白准确打印复杂解剖结构并进行原位成像的能力，且具有较小的打印偏差，不影响打印保真度。

图6：原位OCT监测和三维图像重建的医学成像衍生的新打印结构

结论

研究人员开发了一套集成OCT的3D生物打印机；使用高对比度的胶原生物墨水，提高OCT图像的信噪比和对比度；在透明明胶微粒支撑浴中进行3D打印和OCT成像，明胶支撑浴中的连续打印不会干扰柔软、容易变形的水凝胶生物墨水；打印过程中OCT成像可实现打印结构的3D重建，进而检测打印结构与打印模型之间的尺寸偏差、打印缺陷以及结构内部误差。该研究为打印质量评估提供了一种全面的方法，为实现工程组织的临床转化所需的生产和过程控制提供了方案。

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