【导读】
光学相干层析成像（OCT）是基于低相干干涉测量的3D成像技术，能够在散射组织中实现毫米级深度穿透、高灵敏度的高速、三维体积成像，在眼科、心脏病学和胃肠道等多个领域具有广泛应用。但OCT的相干检测机制使其横向分辨率与焦深存在制约，且其存在的散斑噪声容易使有用的生物信息淹没在OCT图像中。
近期，杜克大学的Kevin C. Zhou和Joseph A. Izatt等人在Optica上发表了题为Computational 3D microscopy with optical coherence refraction tomography的研究新成果。为实现更准确的医学诊断成像，研究人员在OCT基础上提出了一种新的计算体积显微镜技术：采用多角度非相干k空间合成重建算法的三维光学相干折射层析成像（optical coherence refraction tomography，OCRT）。3D OCRT不仅具有OCT的相干检测灵敏度优势，而且还具有类似于非相干显微镜的无散斑非相干对比度机制，以及在扩展3D视野上多重增强的横向分辨率。3D OCRT主要有两方面关键创新：第一，研究人员展示了一种新颖的光机设计，该设计利用抛物面镜作为成像物镜，在不移动样品的条件下可从多个角度对样本进行成像，成像角度达±75°。研究人员演示了5D全景数据集的采集（3D空间+2D角度），并通过计算合成新的3D对比度图像。第二，为了处理这些大型5D数据集，研究人员提出一种新的、计算高效的3D计算重建算法，该算法利用可微编程框架（TensorFlow）和深度学习技术对多角度的5D数据集进行处理。
OCT是一种以带通相干传递函数（CTF）为特征的相干成像模式，OCRT与2D和3D相干合成孔径技术的不同之处在于，多角度OCT体数据通过丢弃相位仅对强度进行操作。根据维纳-辛钦定理，实数空间中OCT图像的幅度平方对应于k空间中的自相关，因此OCRT对相位稳定性要求不高。
由于这些解调的CTF或非相干传递函数（ITF）在K空间原点重叠，因此当OCT分辨率为各向异性时，可以将它们组合以形成扩展的ITF（图1（f））。通常横向分辨率大于10μm，轴向分辨率通过光源特性进行调节，可达到亚微米级。最后，因为散斑与角度分离的函数无关，非相干的角度合成图像中散斑显著减少。
为提高分辨率，需要在宽角度范围内获取多个OCT体数据。为此，研究人员用反射凹面抛物面镜作为成像物镜，通过与样品共轭和反共轭放置的扫描仪，该物镜能调整入射样品的2D横向位置和2D角度[图1（a-c）]。实验装置还有放置在镜子焦点处的半圆状水箱，样品放置在该位置[图1（a、b）]，以大幅减少聚焦光束在平坦折射率（RI）不连续（例如，盖玻片）界面上倾斜折射时产生的球面像差。
C．联合OCT体数据配准和计算三维重建
为了得到5D数据集，3D OCRT的目标是融合多角度OCT体数据，以实现前面描述的非相干3D K空间合成和散斑抑制。配准算法联合优化了两组参数：（1）样本外部参数，或描述样本入射光线位置和方向的参数，由成像系统控制；（2）样本内部参数，或描述样本内光线轨迹变形的参数，由其空间变化的RI和光线方程控制。
【结果】
A．横向分辨率增强和散斑抑制效果
研究人员首先对聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品进行成像，验证3D OCRT的分辨率增强和斑点抑制能力，该样品由六边形排列、直径5µm、高5µm的圆柱形微柱组成，边缘间距为5µm[图2（a）]。此外，由于PSF体积探测到多个圆柱[图2（b）]，该OCT图像显示出干扰伪影，这与作为倾斜函数的六边形阵列的模拟OCT响应[图2（c）]一致。图2（j）和图2（k）显示了图2（f）和2（g）沿蓝色和绿色箭头区域的平均1D横截面。从这些1D图可以清楚地看出，OCRT包含OCT没有的预期二次谐波峰值。同时图2（g）也相较于图2（f）抑制了强低频伪影。对图（d）和（e）中的干扰伪影的量化如图（h）和（i）所示，OCRT比OCT窄6.5倍。
图2 OCRT与OCT的图像对比
为了证明3D OCRT实现的通用性，研究人员制作几个固定样本并对其成像：受精后2天的阿塞拜疆鱼幼虫（图3）、成年果蝇的头部（图4）和各种小鼠组织（图5和6）。在所有样本中，3D OCRT重建都比传统OCT有了实质性的改进。
图3 dpf斑马鱼幼虫OCT和3D-OCRT重建的比较
如图3所示，OCT中的散斑噪声会淹没OCRT中显示的许多特征，导致斑马鱼幼体头部和卵黄囊正面切片的OCT分辨率较差[图3（d-g）]，同时在眼部区域具有强烈的人眼阴影[图3（b、h、j）]。OCRT还显示视网膜层和视神经头[图3（e、i、l）]，这在OCT中不明显[图3（d、h）]。
成年果蝇的OCRT图像相比OCT也存在显著改善。由于斑点减少和横向分辨率增强，复眼的单个小眼、鬃毛和假气管[图4（f）]通过3D OCRT得到更好的分辨。然而，OCT由于存在OCRT中不存在的相干干扰伪影，在鬃毛和小眼处成像质量较差。
与OCT相比，3D OCRT能显著提升对小鼠组织的成像。图5（j、l）的OCRT图像显示了外肌层（ME）的肌纤维，该肌纤维包含外纵肌层（LML）和内环肌层（CML），这两层同样可以在x~z截面观测到[图5（d、f、h）]。在ME下方，研究人员从图5（d、f、h、n）中所示的食管横截面中识别粘膜肌层（MM）、上皮和管腔，这与苏木精和曙红（h&E）染色的组织学切片一致[图5（b）]。而在OCT图像中很难识别所有这些层[图5（c、e、g、i、k、m）]。
图6 小鼠气管OCT和3D-OCRT的比较
与传统OCT相比，3D OCRT在小鼠气管上也有显著改善（图6），显示出OCT中不明显的几层，最明显的是透明软骨环。研究人员还可以识别外膜层（高反射）以及粘膜下层（低反射）和上皮层，而在OCT中大斑点颗粒掩盖了这些层。
【讨论】
研究人员提出的3D OCRT是一种新的计算体积成像技术，通过横向分辨率增强和散斑抑制，大幅提高了OCT体积成像的图像质量。与传统OCT相比，这些改进使OCRT与其他非相干（例如基于荧光的）3D显微镜方法相竞争（如多光子显微镜和光片显微镜），提供互补的无标记的结构对比度。OCRT还继承了OCT的许多其他优点，例如近散粒噪声有限的检测灵敏度和通常使用的较长的近红外波长，这些波长对散射组织的穿透深度较高。综上所述，3D OCRT是一种新的无标记计算三维显微镜技术，它可以在多种生物样本中产生分辨率增强、斑点减少的3D图像，从而显示在传统OCT中不明显的新信息。