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3D打印基质的生化和结构信号诱导MSC干细胞分化为功能性汗腺组织
2020-04-07 来源：捷诺飞 作者：捷诺飞
【导读】
间充质干细胞（MSC）具有自我更新性和多能干性， 3D打印MSC为细胞的组织特异性分化提供了仿生微环境，具备再生医学和细胞治疗的重大潜能。在3D微环境下控制MSC命运的机制是研究和应用的关键。最近，付小兵院士、黄沙教授团队在Science Advances 上发表论文《Biochemical and structural cues of 3D-printed matrix synergistically direct MSC differentiation for functional sweat gland regeneration》，探索了3D打印基质促进MSC分化为功能性汗腺的关键机制。研究利用捷诺飞研发的Bio-Architect® Pro 生物3D打印机,打印类汗腺（SG）组织诱导MSC向功能化SG分化并促进小鼠SG再生。通过细胞外基质分化蛋白表达分析和孵育刺激测试，该团队发现CTHRC1是MSC向SG分化的关键生化调控基因，Hmox1通过响应3D结构刺激参与MSC分化调控，CTHRC1和Hmox1协同放大了SG的基因表达水平。
MSC对于组织工程和再生医学治疗具有重大价值，其分化与微环境调控密切相关，研究细胞外基质（ECM）如何主宰MSC的特异性分化可为基于MSC的细胞治疗提供新思路。在3D ECM中培养细胞相比2D ECM从根本上改变了细胞间的界面作用，对于提供促进新生组织稳定的生物化学和生物物理机制更有利。传统的3D组织工程技术缺乏对材料的空间控制能力，3D生物打印可以自定义设计制造支架和组织，确保高重复性的精确控制复杂结构，使得在空间上整合多种生物物理和生物化学机制调控细胞更为有利。研究团队采用3D生物打印技术仿生SG的再生微环境，诱导MSC细胞的SG特异性分化形成汗腺组织并产生功能。
小鼠只有足趾垫中才有汗腺，而其他部位的皮肤附属器只有毛囊或皮脂腺，说明汗腺生长和发挥功能的微环境特异性很强。研究团队采用海藻酸/明胶复合水凝胶作为基础生物墨水，小鼠足趾垫匀浆蛋白（PD）作为汗腺再生的生化调节剂添加到基础生物墨水中，生物墨水混合MSC细胞添加绿荧光蛋白，采用捷诺飞的Bio-Architect® Pro 3D打印机构建30mm×30mm×3mm的微环境支架（如图1 A和B），在培养过程中发现MSCs在含有PD的微环境中能够增殖，自组装成具有汗腺（SG）类似结构的组织（如图1 C）。
为了进一步验证PD能够在3D打印构建的微环境下直接诱导、促进MSC分化为SG，对体外培养的3D支架进行溶解、细胞分离和转录分析，结果显示含有PD的支架比未含有PD的支架，汗腺的特异性标记物K8和K18表达明显上调，免疫荧光反应的结果也得到了相应的验证（如图2）。
本文采用捷诺飞研发生产的生物3D打印工作机Bio-architect® Pro，图5。
聚焦于单喷头的精准打印
单一材料实现多样化打印方法，可实现水凝胶、无机、合成高分子的单一打印
搭载Distributed-TC和Regen-MIT等技术，可搭配温控、静电纺丝、螺杆挤出、光固化、静电纺等模块化喷头和超高温和超低温冷井平台
高精度高分辨率运动模组
易学易用
模块化喷头设计和打印操作台，上手操作简便
直观的软件，几分钟即可掌握
易清洁
三轴全封闭模组式运动平台，功能集成化高，人性化设计，无死角，易清洁
智能洁净环境控制系统和打印机一体化设计，洁净成型且便于移动
本研究中使用的海藻酸/明胶复合水凝胶，可采用捷诺飞提供的标准封装无菌生物墨水“Bioink Basic”替代。Bioink Basic生物墨水基于明胶和海藻酸复合形成水凝胶，采用专用的R-pure技术纯化处理、生物相容性好，具有温敏特性和阳离子交联特性，3D打印性能稳定，支持直接混合细胞打印或者打印水凝胶支架后接种细胞，可广泛应用于组织工程、细胞治疗、干细胞、肿瘤、药物筛选等生物医学领域的研究与应用。
间充质干细胞（MSC）具有自我更新性和多能干性， 3D打印MSC为细胞的组织特异性分化提供了仿生微环境，具备再生医学和细胞治疗的重大潜能。在3D微环境下控制MSC命运的机制是研究和应用的关键。最近，付小兵院士、黄沙教授团队在Science Advances 上发表论文《Biochemical and structural cues of 3D-printed matrix synergistically direct MSC differentiation for functional sweat gland regeneration》，探索了3D打印基质促进MSC分化为功能性汗腺的关键机制。研究利用捷诺飞研发的Bio-Architect® Pro 生物3D打印机,打印类汗腺（SG）组织诱导MSC向功能化SG分化并促进小鼠SG再生。通过细胞外基质分化蛋白表达分析和孵育刺激测试，该团队发现CTHRC1是MSC向SG分化的关键生化调控基因，Hmox1通过响应3D结构刺激参与MSC分化调控，CTHRC1和Hmox1协同放大了SG的基因表达水平。
MSC对于组织工程和再生医学治疗具有重大价值，其分化与微环境调控密切相关，研究细胞外基质（ECM）如何主宰MSC的特异性分化可为基于MSC的细胞治疗提供新思路。在3D ECM中培养细胞相比2D ECM从根本上改变了细胞间的界面作用，对于提供促进新生组织稳定的生物化学和生物物理机制更有利。传统的3D组织工程技术缺乏对材料的空间控制能力，3D生物打印可以自定义设计制造支架和组织，确保高重复性的精确控制复杂结构，使得在空间上整合多种生物物理和生物化学机制调控细胞更为有利。研究团队采用3D生物打印技术仿生SG的再生微环境，诱导MSC细胞的SG特异性分化形成汗腺组织并产生功能。
小鼠只有足趾垫中才有汗腺，而其他部位的皮肤附属器只有毛囊或皮脂腺，说明汗腺生长和发挥功能的微环境特异性很强。研究团队采用海藻酸/明胶复合水凝胶作为基础生物墨水，小鼠足趾垫匀浆蛋白（PD）作为汗腺再生的生化调节剂添加到基础生物墨水中，生物墨水混合MSC细胞添加绿荧光蛋白，采用捷诺飞的Bio-Architect® Pro 3D打印机构建30mm×30mm×3mm的微环境支架（如图1 A和B），在培养过程中发现MSCs在含有PD的微环境中能够增殖，自组装成具有汗腺（SG）类似结构的组织（如图1 C）。
图1 3D生物打印MSC细胞负载支架的示意图和打印结构的细胞存活、增殖和形态结果
为了进一步验证PD能够在3D打印构建的微环境下直接诱导、促进MSC分化为SG，对体外培养的3D支架进行溶解、细胞分离和转录分析，结果显示含有PD的支架比未含有PD的支架，汗腺的特异性标记物K8和K18表达明显上调，免疫荧光反应的结果也得到了相应的验证（如图2）。
图2 有无PD添加下3D生物打印MSC支架的SG特异性转录和翻译水平及分泌相关标记物
为了阐明3D打印微环境如何促进分化过程中的MET-EMT转变，研究团队监测了MSC分化过程中上皮标记物和间充质标记物的mRNA表达水平，实验发现PD的存在并不会导致MET-EMT过程发生，而3D结构可能参与MSC特异性分化。为进一步弄清MSC细胞腺体特异性分化的生化机制，采用蛋白组学定量分析了PD和小鼠背部真皮DD的ECM分化表达，结果发现一个高水平表达的蛋白CTHRC1，转录组学分析显示3D支架结构因素促进了MSCs中Hmox1基因表达的上调。免疫组化染色揭示了CTHRC1和Hmox1协同调控诱导MSC中对于汗腺发生至关重要的BMP2基因的表达（图3）。
图3 CTHRC1和Hmox1基因协同促进MSC分化为SG
研究团队将带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的3D打印MSC支架移植到烧伤小鼠爪子上，实验证明诱导分化的MSC可以在形态和功能水平上直接修复受损的SG组织（图4）。该研究揭示了3D支架微环境与关键分子对于汗腺再生的重要性，为进一步实现汗腺再生提供了基础。
图4 热损伤小鼠模型移植3D打印MSC支架后汗腺修复的实验结果
本文采用捷诺飞研发生产的生物3D打印工作机Bio-architect® Pro，图5。
聚焦于单喷头的精准打印
单一材料实现多样化打印方法，可实现水凝胶、无机、合成高分子的单一打印
搭载Distributed-TC和Regen-MIT等技术，可搭配温控、静电纺丝、螺杆挤出、光固化、静电纺等模块化喷头和超高温和超低温冷井平台
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图5 Bio-architect® Pro
图6 Bioink Basic--海藻酸/明胶复合水凝胶
原文链接：https://advances.sciencemag.org/content/advances/6/10/eaaz1094.full.pdf