【导读】

甲壳素衍生的水凝胶得益于较高的细胞相容性被广泛应用于骨再生研究。然而，较差的力学性能，以及水凝胶材料与宿主细胞之间的作用机制尚不明确，限制了甲壳素水凝胶在临床上的实际应用。最近，华中科技大学同济医学院骨科肖骏教授、广东省医学科学院张余主任和武汉大学化学系蒋序林教授团队在Theranostics发表了题为"Mesenchymal stem cell-loaded thermosensitive hydroxypropyl chitin hydrogel combined with a three-dimensional-printed poly(ε-caprolactone)/nano-hydroxyapatite scaffold to repair bone defects via osteogenesis, angiogenesis and immunomodulation"的文章，研究团队利用新型合成的温敏羟丙基甲壳素水凝胶（HPCH）包裹间充质干细胞（MSC），创新性的与基于捷诺飞研发的生物3D打印机Bio-Architect^® pro打印的聚ε-己内酯与羟基磷灰石（PCL/nHA）支架相结合，探索MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架促进骨再生的能力。

骨组织工程通过天然或合成生物材料支架促进骨再生，是一种修复骨缺损的有效方法。间充质干细胞（MSC）具有分化成骨骼、软骨和骨髓脂肪细胞的功能，是骨组织工程的关键成分，如何有效制备载有MSC的生物支架实现骨缺陷修复功能意义重大。

聚合物PCL具有较高的生物相容性且降解产物无副作用，是一种比较适合于低温3D打印生物支架的生物材料；羟基磷灰石（HA）能够刺激巨噬细胞分泌血管生长因子和成骨生长因子从而促进骨再生；研究团队制备出PCL/nHA复合支架应用于骨缺损修复研究。然而体内移植过程中，PCL/nHA支架可能会激活巨噬细胞产生炎症反应，造成局部组织损伤。这使得直接负载于打印支架上的MSCs成活率较低，对骨愈合的促进作用有限。研究人员进一步利用新型合成的温敏羟丙基甲壳素水凝（HPCH）作为MSCs载体（MSCs-HPCH），并将MSCs-HPCH灌注到3D打印的PCL/nHA支架表面形成复合支架（MSCs-HPCH + PCL/nHA），有效保护MSCs免受炎症环境的损害，如图1所示。通过原位颅骨缺损植入实验，证实了MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架具有增强的骨传导和骨诱导能力，在骨再生研究应用中具有较大的潜能。

图1 MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架的制备与表征

生物材料体内植入时通常会造成体内巨噬细胞活化，转变为经典活化型M1而发生炎症反应。研究发现，MSCs具有较低的免疫原性，可以通过旁分泌机制促进巨噬细胞从经典活化型（M1）向选择性活化型（M2）转化，产生抗炎和组织再生的细胞因子从而缓解炎症反应。

为了验证体内植入MSCs-HPCH后MSCs对巨噬细胞具有免疫调节作用，研究人员将HPCH凝胶和MSCs-HPCH凝胶分别皮下植入到小鼠体内进行实验（如图2A），并结合免疫荧光染色分析巨噬细胞的活化状态。结果发现（如图2B），皮下植入第1天两组体系中均出现较多的炎症细胞即M1型巨噬细胞（iNOS标记），而在植入第7天发现，HPCH凝胶实验组M1型巨噬细胞依然存在（iNOS阳性表达），MSCs-HPCH凝胶实验组中M1型巨噬细胞大量减少，转变为较多的M2型巨噬细胞（CD206阳性表达），这表明MSCs对周围的巨噬细胞具有免疫调节作用，能够促进其向M2状态过渡，从而促进炎症状态向再生状态转变。

图2 MSCs-HPCH对巨噬细胞的免疫调节作用

进一步研究人员评估了MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架体内植入后的骨修复能力。如图3A,B所示，基于Micro-CT对术后9周颅骨缺损修复进行量化分析发现，小鼠右颅缺陷在植入MSCs填充的PCL/nHA + HPCH 复合支架后新生骨体积显著增加，而当左颅缺陷植入无MSCs填充的PCL/nHA + HPCH支架时新生骨相对较少。结合H&E染色深入分析（图3C），各实验组中均有新骨生成，这验证了PCL/nHA支架良好的骨传导能力，而在MSCs填充的PCL/nHA + HPCH 复合支架实验组中表现出大量的新生骨，验证了MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架较强的骨修复能力。

图3 体内植入9周后对颅顶缺陷修复进行Micro-CT 观察和 H&E 染色分析

总结：研究团队提出MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架的创新体系，利用新型合成的温敏羟丙基甲壳素水凝胶HPCH封装MSC干细胞，并结合3D打印的PCL/nHA支架，充分发挥出MSCs促进骨再生的能力。同时，3D打印的PCL/nHA复合支架抗压强度高，能够刺激巨噬细胞分泌促血管生成和诱导骨生长因子，为血管形成和骨再生创造良好的三维环境。实验结果显示该新型MSCs-HPCH + PCL/nHA复合支架体系具有较大的修复骨缺损、促进骨再生的潜能。

本文采用捷诺飞研发生产的生物3D打印工作机Bio-architect^® Pro，图4。
聚焦于单喷头的精准打印
单一材料实现多样化打印方法，可实现水凝胶、无机、合成高分子的单一打印
搭载Distributed-TC和Regen-MIT等技术，可搭配温控、静电纺丝、螺杆挤出、光固化、静电纺等模块化喷头和超高温和超低温冷井平台
高精度高分辨率运动模组
易学易用
模块化喷头设计和打印操作台，上手操作简便
直观的软件，几分钟即可掌握
易清洁
三轴全封闭模组式运动平台，功能集成化高，人性化设计，无死角，易清洁
智能洁净环境控制系统和打印机一体化设计，洁净成型且便于移动


本文用到的基础生物墨水PCL/nHA复合材料，捷诺飞可提供标准封装的无菌生物墨水—Bioink BonePCL+HAP替代。Bioink BonePCL/HAP生物墨水将高分子聚合物PCL和生物陶瓷HAP复合，如图5所示。
采用专用的R-pure & mix技术处理高分子聚合物和纳米无机粉料，复合材料打印更流畅，打印性能佳；
可根据高级客户需要定制PCL与HA比例，也可以定制PCL分子量、HA粒径，更好仿生天然骨的成分与力学性能；
可选择3 mL，5 mL，10 mL，30 mL不同规格，可提供配套高分子无机生物墨水耗材套件（P-Ino Kits），更好适配捷诺飞公司研发生产的打印机；
可克服陶瓷韧性差及聚合物强度差、无生物活性的缺点，实现特性互补优化,打印的支架具有良好的力学性能和生物相容性；
具有优良的骨诱导性，可广泛应用于骨组织工程研究和应用领域。


原文链接：https://sci-hub.tw/10.7150/thno.39167