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核壳生物打印: 骨软骨组织工程空间定位定向分化

2022-06-02　来源：捷诺飞　作者：捷诺飞

【导读】

生物打印的骨软骨组织替代物可用于治疗剥脱性骨软骨炎(OCD)或骨软骨界面的其他组织缺陷。骨软骨组织工程的主要挑战之一是定义具有不同材料特性、细胞类型和生化因素的特定区域，分别支持局部调整分化为成骨和软骨形成谱系。然而到目前为止，大多数研究还不能提供一个概念，将特定的细胞类型和邻近的已定义的因子结合在一个区域定位的结构中。David Kilian、Silvia Cometta等人在Biofabrication期刊上发表了题为“Core–shell bioprinting as a strategy to apply differentiation factors in a spatially defined manner insideosteochondral tissue substitutes”的文章，引入了核壳生物打印这一有效工具，允许在水凝胶链的分离室中传递细胞类型和分化因子TGFβ3和BMP-2，为软骨细胞和成骨细胞提供局部匹配因子。该文中，研究者设计了一个系统，允许独立调整核壳生物打印结构内的功能区室。壳室中细胞的分化将受到整合在核心室中的各个因素的刺激，这些因素应随着时间的推移以足够的量和持续的方式释放。对于骨软骨组织替代物，对单带和双带结构进行了生物打印和表征，比较了局部应用因素与全局应用因素（通过常规添加到细胞培养基中）的影响。评估了该系统作为未来hChon和hOB共培养和共分化概念的适用性。

通过核壳生物打印进行局部因子释放的概念

作为骨和软骨刺激因子，BMP -2和TGFβ3从与外壳中的各个细胞类型紧密接触的核心仓库中释放出来。两个不同的区域被3D打印在一个结构中（图1）：软骨形成区由一个提供TGF-β3的核心和一个载有hChon的外壳组成。掺杂BMP-2的核与结构骨区中的载有hOB的壳直接接触。为了证明这一概念，细胞被嵌入基于alg-MC的外壳中，而核心隔室由Laponite-alg-MC墨水形成，充当支持各个细胞分化的生物活性分子的中心仓库。核壳结构丝是通过核壳生物打印实现的，用不同的染料对各个区域进行可视化。作为研究中使用hChon/hOB方法的替代方案，未分化或预分化的hMSC可以应用于两个区域。不同负载的核心库的空间定义因子供应可以促使它们分化为各自的软骨细胞和骨细胞谱系，同时应避免对各自第二区的潜在干扰影响。因此，如前期实验和前期研究表明，TGF-β3对成骨有不良影响。

图1:核-壳系统的概念

OCT无接触监测核壳链质量和检测细胞分布

光学相干层析成像（OCT）在1300 nm左右的光谱范围内，可以以一种无创、细胞相容性和无接触的方式观察内部同轴链结构。使用这种方法，可以确定两个隔间的非调整同轴方向。正面投影可以从俯视图看到支架的内部模式(图2，右侧柱图像)，证明了整个支架的核心区域是连续的。利用偏振敏感光学相干层析(PS-OCT)成像系统的偏振增强对比度，嵌入的细胞可以通过其去极化特性显示出来。OCT通过允许在原位放置后观察植入物，或通过额外的图像处理来自动评估生物打印明胶/藻酸盐纤维的外部几何形状和通道网络，提供了一种选择打印过程中的直接反馈。该系统对同轴水凝胶链的结构观察和细胞分布的简单可视化有很大的帮助。

图2:核壳支架偏振敏感光学相干层析成像(PS-OCT)

hChon和hOB的核-壳双区共培养

细胞被放置在由生物墨水0-3-9或0-3-9(hP)组成的壳室中，分别用于嵌入hChon或hOB，并与由laponite支持的algc - mc混合物(3-3-3)组成的核心材料结合。hOB和hChon在指定区域进行生物打印，连接界面通过CaCl2介导的藻酸盐网络交联融合，存在于所有使用的生物墨水组合物中(图3A)。在该实验中，支架制作后第1天，hOB的初始存活率约为80%，而hChon的存活率为60%(图3B)。随后，两种细胞的存活率相当平衡(50%-70%)，共培养和单培养没有显著差异。活细胞经钙黄素(图3(d))标记后，分别用荧光显微镜观察DiD- (hChon)和DiI- (hOB)预先标记的细胞，通过cLSM观察21 d后，细胞停留在其确定的间隔内(图3C)。这证明了该装置一般适合于hChon和hOB两种细胞类型的联合制备过程和共培养。形态学分析表明，基于0-3-9(hP)生物墨水，hOB能够在各自的壳腔内粘附和扩散，而hChon保持了其典型的球形形状，分布均匀(图3D)。

图3:hChon和hOB双区共培养的细胞活力和细胞分布

核壳支架的蛋白聚糖表达

在整个实验过程中，所有核壳组和单相0-3-9支架平均细胞存活率在60% ~ 80%左右;在核中添加Laponite对细胞活力没有不良影响(图4A)。形态学分析显示，细胞在链内保持均匀分布并开始形成簇，最显著的是在单相0-3-9对照条件下(从培养基中传递TGF-β3)，而且在核/壳支架中，hChon在经核供给TGF-β3后也存在(图4B)。蛋白聚糖作为软骨ECM的主要成分，在所有条件下主要在细胞外围被检测，在TGF-β3存在时表达最强，要么通过培养基(在单相0-3-9的情况下)，要么在局部(在具有3-3-3 + TGF-β3核心的核壳支架中，图4C)。以3-3-3 + TGF-β3为核心的支架相对于以0-3-9 + TGF-β3为核心的支架有更强的蛋白聚糖表达，这说明该支架具有良好的缓释作用。

图4:hChon在0-3-9壳室分化过程中的细胞活力、形态和聚集蛋白聚糖表达

总结和展望

在本研究中，基于核-壳生物打印的多功能生物制造方法，提出了一种在骨软骨组织模型中空间定位因子和细胞释放的新概念。在一条打印丝内，细胞-软骨区hChon和骨区hOB被特定的生物墨水嵌入壳室; 核是由含laponet的墨水形成的，墨水中装载了特定的分化因子(TGF-β3或BMP-2)，促进了对密切接触的细胞的持续释放。无论是壳型生物墨水还是核型生物墨水，都被证明是有价值的细胞和因子释放功能材料。

基于核壳生物打印的hOB/hChon共培养双区系统的概念证明，为进一步研究细胞的交联和现有因子的互相关铺平了道路。以骨软骨界面和基于alg、MC和Laponite的材料选择为例，展示了生物墨水如何根据细胞的特定需求进行调整，同时通过核心的中心仓库可以独立优化分化因子的释放。未来，这一策略也可应用于其他水凝胶成分、多细胞模型和异质培养系统。

原文信息

David Kilian, Silvia Cometta, Anne Bernhardt, Rania Taymour1, Jonas Golde, Tilman Ahlfeld, Julia Emmermacher, Michael Gelinsky and Anja Lode1. Core–shell bioprinting as a strategy to apply differentiation factors in a spatially defined manner inside osteochondral tissue substitutes. Biofabrication. 2022, 14(1).

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