【导读】

天然组织的功能行使与保守的结构特征有关，例如细胞的排列或细胞外基质成分的编排。因此当寻求构建功能性组织或相关生物模型时，重塑这些结构是至关重要的。近日，帝国理工学院的Molly M. Stevens教授团队利用声学细胞图案化方法构建了具有深层关节软骨解剖特征的组织工程软骨。通过超声驻波，可以将软骨细胞排列成高分辨的“线性”阵列结构，并分布在整个琼脂糖水凝胶内。研究表明，细胞结构可在体外保持5周以上，且可形成定向排列的胶原纤维软骨细胞外基质。该方法将有望阐明软骨细胞的排列结构对胶原纤维的形成与定向编排的作用机制。相关研究论文以“Tissue engineering cartilage with deep zone cytoarchitecture by high-resolution acoustic cell patterning”为题发表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

1、基于天然关节软骨组织结构特征下的声波频率选择

深层区域是关节软骨的四个经典解剖区域之一，位于中间层和钙化层之间，该区域的软骨细胞呈现平行于关节纵轴的特征（图1a）。在人类软骨中，该特征通常是1-2个细胞宽，且间距约为80μm。为此，作者选用了高频（6.7Mhz）的超声驻波，允许软骨细胞在整个琼脂糖水凝胶内排列成单细胞宽度的线性阵列，且阵列间距为111μm（图1b）。

图1. 天然关节软骨组织中的深层细胞排列结构（a）及声学图案下的组织工程关节软骨(b)

2、超声驻波允许软骨细胞快速排列成高分辨阵列结构

为更好地观察细胞排列，作者使用了共聚焦荧光显微镜监测软骨细胞（绿色）在超声驻波场中的运动轨迹。软骨细胞可在声场开启20s内迅速从随机分散的悬浮状态达到平行的线性阵列。进一步计算荧光强度的平均峰值，测得细胞阵列间距为111μm左右，与人软骨的深层细胞间距（~80μm）相当，如图2所示。

图2. 超声驻波允许软骨细胞快速排列成高分辨阵列结构

3、超声驻波对软骨细胞活性与功能的影响评估

接着，为评估超声驻波对软骨细胞的生物影响，作者将软骨细胞暴露在超声驻波下0、3或10min，并将图案化的细胞重新吹散，以避免细胞排列所引起的可能干扰。AlamarBlue实验结果显示，超声暴露(3,10min)和未暴露(0min)的软骨细胞之间的代谢活性没有显著差异。此外，对负载软骨细胞的组织体培养了35天，随后进行二甲亚甲基蓝测试、组织学染色及力学等测试，结果也同样显示超声暴露和未暴露下的硫酸化糖胺聚糖、II型胶原蛋白、I型胶原蛋白的数量和分布，以及压缩杨氏模量等都具有高度的相似性，如图3所示。

图3. 软骨细胞在超声驻波场暴露下未显现生物毒害影响

4、高分辨深层细胞/细胞外基质共排列的透明软骨构建

最后，作者采用1.5% (w/v)的温敏性琼脂糖水凝胶固定声波图案化的细胞阵列（图4a），该阵列具有横向周期分散、纵向连续，且宽度仅为1-2个细胞的天然软骨深层结构特征（图4b,c）。此外，对细胞图案化和未图案化的区域进行染色，结果表明两者的硫酸化糖胺聚糖和II型胶原水平相似(图4d)，然而前者存在显著的纤维网络，且与软骨细胞呈平行共排列(图4e)。这些结果表明声学细胞图案化方法可以将活细胞重塑出具有高分辨率的有序细胞结构，并可重建人关节软骨深区的各向异性细胞和纤维排列。

图4. 声学细胞图案化制备具有深层细胞/细胞外基质共排列的透明软骨

综上所述，作者基于声学细胞图案化方法构建了具有细胞排列特征的深层软骨组织。在长达5周的培养过程中，细胞结构保持不变，且观察到胶原纤维与软骨细胞具有共向排列特征。该方法有望进一步用于研究深层软骨细胞的几何结构和细胞外基质的形成与定向编排之间的复杂相互作用，从而为构建具有各向异质结构和定向力学特性的工程化软骨组织提供新的机会。

【原文信息】

James P. K. Armstrong,* Ekaterina Pchelintseva, Sirli Treumuth, Cristiana Campanella, Christoph Meinert, Travis J. Klein, Dietmar W. Hutmacher, Bruce W. Drinkwater, and Molly M. Stevens*, Tissue Engineering Cartilage with Deep Zone Cytoarchitecture by High-Resolution Acoustic Cell Patterning, Adv. Healthcare Mater. 2022, 2200481.