【导读】
近年来，类器官作为研究器官发育、疾病机制、再生医学、药物毒性和许多其他应用的体外三维(3D)模型受到越来越多的关注。类器官是自组织的体外模型，由器官特定类型的细胞组成，模拟器官功能，并形成器官样结构。在人类器官类器官模型的研究中，由于人类心脏结构的复杂性，人类心脏类器官(hHOs)的研究进展较少。早期hHOs的研究依赖于3D支架，在支架上培养人类干细胞或分化的心脏细胞，并引导其形成预先设计的3D结构(如直接组装)。然而，通过直接组装制造的心脏类器官往往不能捕获重要的体内特征，包括多种细胞类型，细胞比例和密度，复杂形态以及生理发育。近期，美国圣路易斯华盛顿大学Zhou Chao教授团队在Biosensors and Bioelectronics上发表了题为Longitudinal morphological and functional characterization of human heart organoids using optical coherence tomography的研究新成果。在该工作中，研究人员从人类多能干细胞(hPSCs) 自主开发了自组装人类心脏类器官(hHOs)，并利用自定义的光谱域光学相干层析成像(SD-OCT)系统来表征人类心脏类器官的生长。人类心脏类器官的腔体结构和跳动图可通过OCT和钙离子成像观察到。其证明了OCT以快速、无标签和非破坏性的方式产生3D图像的能力。在实验中发现hHOs中形成大小不一的空腔，早在分化第4天就可见复杂的相互连接。最终，结果表明hHOs模型和OCT成像系统作为研究心脏发育和疾病机制的体外平台显示出光明的前景。
1、实验设置
人类心脏类器官的制造方案示意图如图1（A）所示。带箭头的坐标单位是天，并展示了每个时间点需要进行的处理。从第1天到22天每天进行OCT采集，从第24天到第30天每隔1天进行一次OCT采集。OCT安装原理如图1（B）所示，左下是第27天hHOs的3D渲染图。在这个定制的光谱域OCT (SD-OCT)装置中，使用中心波长为1320 nm、光谱范围为110 nm的超发光二极管作为宽带光源。信号由光谱仪检测。光谱仪包含一个1024像素的InGaAs行扫描相机，具有高达20 kHz的A扫描速率。其横向分辨率约为7 μm。假设心脏组织折射率为1.38，轴向分辨率约为4.9 μm。样本用5倍物镜成像。一个由计算机控制的机动样本台，上面有一个96孔的培养皿，心脏类器官在培养皿中生长。
图1 实验装置
2、具有代表性的人类心脏类器官的空腔重塑
具有代表性的hHO的三维效果图、正面和横截面视图以及腔室分割如图2所示。第14天，在类器官中总共观察到36个独立的腔体，体积从2.2 ×10-5 到0.059 mm³不等。第16天使用OCT对相同的类器官成像，空腔总数减少到11个，小体积空腔数量明显减少，最大空腔体积增加到0.086 mm³，表明空腔发生了积极的重塑。
图2 具有代表性的人类心脏类器官的OCT成像和3D绘制
3、心脏类器官的空腔与心脏类器官高度和直径时序变化
同一个心脏类器官在不同天数的横切面如图3（A）所示。从第3-4天开始在hHOs内观察到较大的腔室。腔室的数量、大小和整体形态变化很大。第6天到第16天观察到腔室合并和扩大。从第16天开始，腔室的数量和大小都在减少。到第30天，没有观察到大的空腔。不同天数人体心脏类器官的平均高度和直径如图3（B）所示。实线表示平均值，阴影表示标准差。图中标注表示线性增长阶段I和II。
图3 OCT长期成像
4、具有代表性的人心脏类器官跳动的特征
由OCT检测的hHOs跳动特征如图4（A）所示。在收缩过程中，底部腔室收缩，阀状结构(红色箭头所示)切换到闭合状态。GCaMP6f荧光成像表征的hHOs跳动如图4（B）所示。从记录中选取相同跳动周期内的6个代表性帧。所有帧都有时间标记。圆形箭头表示每个帧组的时间顺序。hHOs跳动的轨迹如图4（C）所示。左边的蓝色曲线表示从面板A中红色虚线框测量到的腔室高度的变化。右边的蓝色曲线表示有代表性的分组像素的GCaMP6f荧光强度的变化。OCT和钙成像测量的搏动间隔(IBIs)如图4（D）所示。每个标记代表一个时间间隔。每种颜色代表一个hHO。对具有代表性的hHO的分析显示，搏动过程中腔室收缩明显。钙信号从相同的器官传播被记录下来。波形表现为典型的波形钙的瞬态，快速上升和指数衰减。用OCT观察到的另一个有趣的跳动模式涉及图4（A）所示的阀状结构。当较低的腔室收缩时，阀状结构切换到关闭状态，并对相邻的两个腔室进行物理隔离。由于OCT系统具有较高的三维成像能力和成像深度，可见hHO内部的阀状结构。相比之下，标准的亮场或荧光成像都不能分辨类器官内部的阀状结构。
图4 具有代表性的人心脏类器官跳动的特征
5、典型hHO的免疫染色和共聚焦成像
典型hHO的免疫染色和共聚焦成像如图5所示，免疫染色和共聚焦成像显示，hHOs形成了血管结构。事实上，PECAM1-阳性结构表明了血管网络的形成。图5（A）表示hHO的概貌。图5（B）表示图5（A）的放大视图。hHO在第30天被固定并且用内皮细胞标记PECAM1(红色)、心肌细胞标记TNNT2(绿色)和细胞核标记DAPI(蓝色)染色。PECAM1-阳性结构揭示了贯穿hHO的血管网络的形成。通过共聚焦显微镜获得z方向的最大投影生成图像。
图5 典型hHO的免疫染色和共聚焦成像
6、总结与展望
心脏在不同的阶段有不同的形态，利用OCT对类器官进行表征对于开发特定发育阶段的心脏类器官模型至关重要。除了功能腔室的形式外，该工作对心脏瓣膜、血管细化和三维跳动模式的观察为类器官模型提供了坚实的验证。这项工作进一步证明了OCT在跟踪hHOs这些特征方面的潜力。hHOs方案和OCT都有显示出研究人类胎儿心脏的良好潜力，可作为研究人类心脏不同发育阶段的起点。